农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法（三） 残留距离越近作用力越强

抗原与抗体问非共价键力能否起作用以及作用力的农药大小与两分子的距离密切相关，只有两分子表面广泛接触并精密“契合”时非共价键力才能起作用，残留距离越近作用力越强。酶的免抗原与对应抗体之间高度的活性空间互补结构恰好为这些结合力作用的发挥提供了条件。

2、抑制疫分抗原抗体亲和性及亲和力：在免疫化学中，免疫一般用亲和性(amnity)和亲和力(avidity)两个术语来表示抗原抗体结合能力的分析大小。

亲和性是技术指抗体分子上一个抗原结合位点与对应的抗原决定簇之问的相适性与结合力。

而亲和力是析法指反应体系中复杂抗原与相应抗体之间的总的结合力。亲和力与亲和性有关，农药也与抗体的残留结合价和抗原的有效决定簇数目相关。例如IgM分子与相应抗原的酶的免亲和力是其5个单体的亲和性之和。一个复杂抗原与相应抗体的活性亲和力是多克隆抗体系统中多种亲和性之和，而在单克隆抗体反应系统中则只有某一个决定簇起作用，抑制疫分所以单克隆抗体与相应抗原的免疫亲和力一般比多克隆抗体弱。

3、抗原抗体反应的过程抗原与相应抗体从混合到出现可见反应，其问经过一系列的化学变化和物理变化，包括了抗原与抗体特异性结合和非特异性凝聚两个阶段，即由亲水胶体转为疏水胶体的变化过程。

抗体分子是球蛋白，许多抗原是蛋白质或其他能够形成亲水胶体的大分子物质。在通常的血清学反应条件下，极化的水分子在其周围形成水化层，成为带有负电荷的亲水胶体，因此不会自行聚合形成沉淀。当抗原与抗体结合后，抗原抗体复合物与水接触的表面积缩小，表面电荷减少，水化层变薄，胶体的稳定性降低。上述过程由抗原与抗体的特异性结合直接引起，一般可在数秒内完成，并很快达到平衡，但不出现可见反应现象。如果反应系统中有电解质存在(一般情况下是存在的)，就会使抗原抗体复合物的水化层彻底破坏，各疏水胶体之问易于靠拢聚集，形成大的、可见的抗原抗体复合物。这一过程是非特异性反应，速度较为缓慢，需要数分、数小时乃至数日，而且这种非特异性反应受抗原与抗体的量比关系和环境条件(例如pH、温度等)影响。

4、抗原抗体反应的类型根据抗原抗体反应所产生的现象和结果的不同，传统的血清学反应分成5种类型：①可溶性抗原与相应抗体结合所发生的沉淀反应(precipitation)；

⑦颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的聚集反应(agglutination)；③抗原与抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应(cytolysis)；④细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应(neutralization)；⑤免疫标记的抗原抗体反应，这是现代免疫学技术的重要发展，也是农药残留免疫分析技术的基础。

5、抗原抗体反应的特点

(1)特异性：特异性(specificity)是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子高变区之间空间结构的互补性决定的。抗体分子N端可变区可形成大小约3nm×1.5nm×0.7nm的槽沟，其中高变区氨基酸残基的变异性使槽的形状千变万化，只有与其空间结构形成互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入，其关系犹如锁和钥匙。因此抗原抗体结合反应具有高度特异性。许多抗原的构成十分复杂，含有多种抗原决定簇。如果两种不同的抗原分子上具有相同的或相似的抗原决定簇，则有可能与彼此相应的抗体发生交叉反应。

(2)比例性：比例性(proportionality)是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量--比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应。以沉淀反应为例，在加入固定量抗体一排试管中依次加入一定体积系列浓度的抗原进行反应时，发现随着抗原浓度的增加，沉淀很快大量出现，但超过一定范围之后，沉淀速度和沉淀量随抗原浓度增加反而迅速降低，甚至到最后无沉淀出现。沉淀反应的速度反映了参加反应的抗原和抗体浓度的适合程度，适合程度高时反应快，反之则慢。沉淀速度最快时的抗原与抗体浓度比称为最适比(optimalradtio)，亦称为抗原抗体反应的等价点。实验证明，在同一抗原抗体反应系统中，不管抗原和抗体浓度如何变化，其沉淀反应最适比始终恒定不变。

在最适比反应条件下，理论上抗原抗体基本全部结合，上清液中几乎无游离抗原和抗体。实际上在抗原稍有过剩时形成的沉淀物最多、最大。当抗原和抗体浓度比超过此范围时，沉淀速度和沉淀量都会迅速降低，甚至不出现沉淀。根据定量沉淀反应，可以将抗原抗体反应分成3个区带：①等价带(equivalence zone)；②抗体过剩带，亦称为前带(prozone)；③抗原过剩带，亦称为后带(postzone)。

天然抗原大多是多价的，抗体至少有两价。根据网络学说，当抗原和抗体在等价带结合时，相互交叉形成网络，易沉淀形成肉眼可见的复合物。当抗原或抗体过剩时，因过剩方的结合价得不到饱和，只能形成小网格复合物，而且反应系统中有剩余游离的抗原或抗体。当抗原或抗体为单价时，不管抗原和抗体的量比关系是否合适，均不能出现肉眼可见反应现象。

(3)可逆性：可逆性(reversibility)是指抗原与抗体形成复合物后，在一定条件下可解离，恢复为游离抗原和游离抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以在一定条件下解离。解离后抗原或抗体可与其他对应抗体或抗原再结合，在整个反应系统中达到一种动态的平衡，平衡反应的倾向性取决于抗原与抗体的亲和力、抗原和抗体的浓度、环境因素等。

免疫复合物在适当条件下解离后，游离出来的抗原或抗体仍保持原来的理化特征和生物学活性，利用这一特征可以分离纯化特异性抗体或抗原，这是以抗原或抗体作配体的免疫亲和色谱技术的基础。

6、影响抗原抗体反应的主要因素单纯用抗原抗体分子结构互补及非共价键力的大小来确定抗原抗体的亲和力是不全面的，抗原与抗体的结合还受其他反应物自身因素和环境因素的影响。

(1)反应物自身因素

①抗体的来源和类型：抗体的特异性与亲和力是抗原抗体反应中的两个关键因素，来自不同动物个体的抗血清，其免疫反应性存在差异。免疫动物的早期获得的抗血清特异性较好，但亲和力偏低。免疫后期获得的抗血清一般亲和力较高，但长期免疫易使抗血清中抗体的类型和反应性变得复杂。单克隆抗体的特异性强，但其较低的亲和力一般不适用于沉淀反应或凝集反应。

②抗原和抗体的浓度：抗原抗体反应中，抗体的浓度是与抗原对应的。为了得到好的反应效果，通常采用方阵(横竖交叉)实验法筛选抗原与抗体的最适浓度组合，以求得最佳实验结果。

③抗原的特性：抗原的理化性质、抗原决定簇的数目和种类均可影响抗原抗体反应的结果。如可溶性抗原与相应抗体的反应类型是沉淀，而颗粒性抗原的反应类型是凝集，单价抗原与抗体结合不易出现可见反应。

(2)环境条件

①反应介质的pH：适当的pH是抗原抗体反应取得正确结果的另一影响因素。抗原抗体反应一般在pH 6～9的反应介质中进行，超出这个范围，无论过高还是过低，均可直接影响抗原抗体反应性，导致假阳性或假阴性结果。

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